熒光壽命的測定

吸收光后，分子在釋放吸收的能量之前保持一定時間的電子激發(fā)態(tài)。在這里，不同的光化學過程以不同的概率相互競爭。除了無輻射失活外，還可以發(fā)射光，例如以熒光的形式。
之后激發(fā)分子數（n1）已降至1/e的系數（約37%），稱為熒光壽命（τ佛羅里達州):

n1（t） = n1（0） e（- t / τ佛羅里達州)

有機染料的衰減行為可以用來識別它。然而，熒光壽命(熒光衰減時間)不是一個固定的量，而是受染料所處環(huán)境即溶劑和溫度的影響。

ATTO染料 的熒光壽命通常在納秒范圍內（10 -9秒）。對于我們的目錄，使用下述“時間相關單光子計數"方法確定 22 °C 水溶液（PBS，pH 7.4）中羧基衍生物的值。為此使用了來自HORIBA Jobin Yvon的使用壽命測量設備TemPro 。


時間相關單光子計數 （TCSPC）
激發(fā)后熒光光子的發(fā)射是一個統計過程。因此，單個分子保持激發(fā)態(tài)的持續(xù)時間也是一個統計量。然而，如果我們觀察許多相同分子的集合，我們會得到一個定義明確的衰變統計量。
在當今常用的熒光壽命測量方法TCSPC方法中，這些統計數據的時間分辨非常好 - 低至皮秒范圍（10-12 s） – 并以高檢測靈敏度進行測量。為此，用周期性的極短光脈沖照射樣品。激發(fā)后，樣品發(fā)射熒光光子。測量第一個光子到達探測器之前的確切時間量。這些單個事件被計數，即作為“計數"輸入直方圖。隨著這種單個實驗的非常頻繁的重復，最終通過加計數來獲得樣品衰變曲線的指數過程。

在每個激光脈沖和計數過程之后，必須重置測量電子設備。在此死區(qū)時間內無法記錄任何光子。因此，以每 100 個激發(fā)脈沖僅檢測到約 1 個光子的方式選擇條件。否則，在較高的速率下，直方圖中的短時間會被高估并且衰減曲線會扭曲（“堆積"）。實際上，測量通常以所謂的“時間反轉"模式進行，即熒光光子開始時間測量，而由另一個二極管記錄的激光脈沖停止時間測量。

在測量染料樣品之前，應提供有關染料的以下信息：

• 吸收和熒光最大值，例如來自溶液或文獻值的吸收和熒光光譜的測量。

• 熒光衰減時間的近似數量級，例如根據以前的測量、可比系統的測量或文獻值估計。

光譜數據決定了激發(fā)光源的選擇——如今通常使用強激光或半導體二極管——以及用于發(fā)射光譜選擇的截止濾光片的選擇。應選擇此濾光片以防止散射的激發(fā)光到達檢測器。

除了選擇合適的激發(fā)光源和合適的邊緣濾光片外，還必須遵守其他實驗要求：

• 樣品溶液在激發(fā)波長及以上的1cm比色皿中的吸光度應<0.1，以避免重吸收。例如，稀釋溶液還可以防止由聚集和濃度缺失引起的問題。

• 散射樣品溶液會導致評估期間意外縮短壽命的“出現"。例如，可以通過μ過濾樣品溶液來避免這種情況。

• 通常，透明液體在 1 厘米熒光比色皿中以 90° 排列的方式測量。

• 檢測時間窗口應足夠長（至少 10000 個計數）。

在根據TCSPC原理進行熒光壽命測量的情況下，還需要確保計數率不超過脈沖激發(fā)光源重復率的2%。如上所述，這避免了所謂的“堆積"。

為了降低計數率，

• 稀釋供試品溶液。

• 中性玻璃濾光片可以插入激發(fā)通道，從而降低激發(fā)光的強度。

• 可以將波長較長的邊緣濾光片插入發(fā)射通道，從而減小檢測到的熒光的光譜范圍。

要將計數率提高到 2%，可以應用反向度量。

在測量熒光衰減時間時，還應測量散射溶液.dem例如0.01%Ludox AS40膠體二氧化硅溶液，以確定儀器功能，即電子器件的響應。這種參考測量的結果可以在以后的數據評估中考慮在內。

通過提供的軟件進行數據分析。在這里，測量的數據點由曲線擬合。熒光衰變曲線的理論過程與放射性衰變一樣，對應于一階反應，因此是單指數的。但是，它也可能導致更高的指數曲線，以便更好地擬合測量點。例如，在一個溶液中存在具有不同熒光壽命的不同物種時，可能就是這種情況。

下圖說明了一批 阿托 488 卡波西與 天寶裝置。可以識別上述參數，例如檢測時間窗口（峰計數>10000），使用Ludox溶液的參考測量/提示以及樣品的測量。CHISQ = 1.1 且標準差均勻分布的雙指數評估結果證明是最佳擬合的。熒光衰減時間 阿托 488 22 °C 水溶液 （PBS， pH 7.4） 中的羧基為 4.1 ns，該樣品中的相對比例為 96.78 %。



軟件中選擇的補償曲線的質量以及確定的熒光壽命的正確性等由參數χ2 （CHISQ，XSQ）和加權殘差。
良好的契合度可以通過以下方式識別：

• χ 2 < 1.2 并且在添加另一個組件時沒有顯著變化（單指數 -> 雙指數等）

• 加權殘差的均勻分布，標準差

• 與以前的測量值或文獻值一致

商業(yè)設備的供應商提供大量的手冊和產品文檔，通常詳細描述相關設備的正確操作和所提供的軟件。通過遵守給出的說明，例如，測量具有已知熒光衰減時間的染料，您將擁有必要的常規(guī)和經驗來測量所用設備的“正確"壽命